SSRマーカーに基づく小豆とその近縁種の遺伝的多様性

SSRマーカーに基づくアズキとその近縁種の遺伝的多様性に関する研究
Lixia Wang, Xuzhen Cheng*, Suhua Wang
中国農業科学院作物科学研究所、北京、100081

概要

アズキの育種におけるVignaの遺伝資源の利用を促進するため、87個のSSRマーカーに基づいて遺伝的二重性と関係を分析した。その結果，栽培されている80種，野生のアズキ22種，親戚の10種を含む112種のVigna属植物において，これらのSSR遺伝子座で667の対立遺伝子が脱保護されていた。そして、栽培植物、野生のアズキ、親戚の植物でそれぞれ75、71、82が多型であった。ランダムサンプリング分析の結果，SSR遺伝子座あたりの平均対立遺伝子数は，親戚の植物が第1位，野生のアズキが第2位であり，多型情報量（PIC）と一致していた。クラスター分析では、栽培植物、野生アズキ、および関連植物を3つの異なるグループに分けた。栽培された小豆の遺伝的背景は、基本的にその起源と一致していた。栽培された小豆の遺伝的背景は、基本的に原産地と一致していた。相対する植物も3つのサブグループに分けることができ、V. umbellataは他の野生種と異なる遺伝的背景を持っていた。本研究は，野生のVignaが栽培されている小豆よりも高い遺伝的変異を持っていることを示唆しており，この作物の遺伝子プールの拡大に利用できる可能性がある。

小豆（Vigna angularis）はササゲ属の栽培種であり、中国では伝統的な輸出商品である（Zheng Zhuojie, 1995）。 2009年初頭、国家食用豆工業技術システムが、国内の各産業の技術ニーズを調査した結果、病気や虫に強く、耐病性があり、高収量で高品質な品種の需要が第1位であることがわかりました。 現在、中国では5,000以上の生殖質資源が収集・保存されており、そのうち3,000以上がカタログ化されています（Zheng Zhuojie, 1987, 1990; Hu Jiapeng et al, 1996）。 これらの資源のうち、98％以上が国産材であり、外国産材は主にオーストラリア、タイ、日本からのものです。 中国のレンズ豆の生殖資源には、豊富な表現型のバリエーションがあるだけでなく（Tian Jing and Zhao Chunxia, 2001; Wei Shuhong et al., 2004; Wang Shumin et al. しかし、これらの栽培されている豆類の生殖質資源には、害虫抵抗性、ストレス耐性、高品質のための有益な遺伝資源が不足しており（Liu Changyou et al, 2009）、現段階では豆類の育種にブレークスルーをもたらすことは難しい。 そのため、ダイズの遺伝子プールを充実させるためには、新しい抵抗性や品質の遺伝子を見つけることが重要である（Yu Shaofan et al, 1997; Wei Shuhong, 1998; Chen Xuezhen et al, 2001）。 近年、ダイズに近い野生種（Qi Ning et al, 2006; Yang Guangyu et al, 2007）、イネ（Zhao Weidong et al, 2007）、コムギ（Ren Zhilong et al, 2007）の病害抵抗性や高収量の遺伝子が育種に利用されているほか、野生の緑豆（Vigna ra-diata var. sublobata）のマメコガネに対する抵抗性の遺伝子も育種に利用されている( Tomooka et al., 1992; Lambrides & Imrie, 2000; Lin et al., 2005)を参照してください。 したがって、野生のキビやササゲの野生親戚の優れた遺伝子を徹底的に調査することは、栽培キビの遺伝子育種に画期的な進歩をもたらす上で重要な役割を果たすと考えられる。しかし、中国における野生のヒヨコ豆とその近縁種の収集は比較的遅れています。 2005年からササゲ属の野生植物の全国調査が行われています。 これらの野生資源には、多穂性、耐乾性、耐病性などの優れた遺伝資源が含まれているのではないかと推測されています。 ササゲ属の野生親類は、表現形質の違いが小さいため、正確に分類することが難しく、育種に利用することができません。 野生の親戚を分類するためのDNA分子マーカーの利用が進んでおり（Yang Ping et al. 2004; Tian Songjie et al. 2004; Cai Qing et al. 2005; Zhang Bingbing et al. 2008）、特にSSRマーカーは、共優性があり、シンプルで低コストという利点があり、遺伝的多様性の研究に広く利用されている。 本研究では、栽培豆、野生豆、近縁種の豆について公表されているSSRマーカー（Wangら、2004年、Hanら、2005年）を用いて、遺伝的多様性の比較分析を行い、遺伝的関係を探ることで、中国産豆類の生殖質資源の評価・同定や、野生種の優れた遺伝子の利用の参考にした。

材料と方法

実験材料

112の資料は、栽培されているレンズ豆、野生のレンズ豆、近縁の植物の3つのカテゴリーに分けられました。 そのうち、80個はレンコンのコア生殖質バンクから、77個は中国の14省（吉林省9、河北省9、北京市9、天津市6、山西省4、内モンゴル自治区5、黒龍江省7、江蘇省6、遼寧省6、湖北省5、河南省2、安徽省4、雲南省3、陝西省2）から無作為に選び、3個は外国から導入した資源から無作為に選んだものです。 22種類の野生のピントマメと10種類の近縁種（3種類のササゲと7種類の野生種を含む）が日本から導入されました。

DNA抽出とSSR分析

各植物の健康な種子を2～3個選び、栄養ボウルに播種した。 第1葉の三つ葉の若葉を採取し、CTAB（Doyle & Doyle, 1987）により全ゲノムDNAを抽出した。 濃度はUV分光光度計で測定し、ddH2Oで10ng/μLの作業濃度に希釈して使用した。
PCR増幅反応は、Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 thermal cyclerを用いて行った。 反応量は20μLで、1×PCRバッファー、2mM MgCl2、0.1mM dNTP、0.4μMプライマー、20ng DNA、1U Taq DNAポリメラーゼを含む。 反応手順は，95℃で5分間の予備変性，94℃で30秒の変性，30秒のアニーリング，72℃で30秒の伸長，35サイクル，72℃で5分間の伸長であった。 増幅産物は，6％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し，銀染色で染色した（Bassamら，1991；Vantoaiら，1996）。

データ処理

データはPCR増幅断片に応じてSSR遺伝子座ごとに別々に読み込まれ、すなわち対立遺伝子変異の移動度に応じて適切なフォーマットに変換され、解析ソフトの要求に応じて使用された。 生殖細胞間の内在性遺伝的類似性係数の算出には、算術平均を用いた非加重ペアグループ法（UPGMA）を用い、主成分分析（PCO）と樹形分析にはNTSYS-pc2.10を用いた。NTSYS-pc2.10を主成分分析（PCO）と木のクラスタリング（Rohlf, 1992）に使用し、多型情報量（PIC）はPopGen32ソフトウェアパッケージ（Yeh & Boyle, 1997）を用いて計算し、ランダムサンプリング分析は浙江大学のH. Xu氏が開発したALLELENUMプログラム（未発表）を用いて行った。 ランダムサンプリング分析は、浙江大学のH.Xu氏が開発したALLELENUMプログラム（未発表）を用いて行い、遺伝的多様性の評価におけるサンプルサイズの影響を軽減しました。 その他の統計解析やプロットはすべてExcelで行いました。

結果

遺伝的多様性

87のSSRプライマーペアにより、112の小豆とその近縁種から合計667の対立遺伝子が検出され、1ペアあたりの平均対立遺伝子数は2から22までの7.58であった。 最も多かったプライマー（22）はX25（LG1）とX167（LG9）で、4組（4.6％）のプライマーが2つの対立遺伝子のみを検出した。 対立遺伝子の頻度は0.89％から95.54％で、平均11.96％でした。49個の対立遺伝子（7.35％）は50.0％以上の頻度で、つまり49組のSSRプライマーが支配的な対立遺伝子を検出していました。 多形情報量のばらつきは0.036～0.942で、平均0.504でした。多形情報量が最も多かったプライマーはX25、最も少なかったプライマーはX74で、それぞれダイズの第1連鎖群と第4連鎖群に位置していました。 多型情報量が0.5以上のSSRの数は53で、60.9%を占めていた。

異なる個体群における遺伝的変異の分布と比較

調査した87個のSSR遺伝子座のうち、栽培植物、野生植物、その他の近縁の植物グループにおいて、それぞれ75個、71個、82個が多型性を示した。 SSR遺伝子座あたりの対立遺伝子の平均数は、栽培個体、野生個体、近縁種個体でそれぞれ4.9、3.7、5.1であり、平均多型情報量は0.48、0.54、0.62であった。ランダムサンプリング分析の結果、サンプル数が22の場合、栽培レンズ豆の平均対立遺伝子数は2.7であり、野生レンズ豆22の平均対立遺伝子数よりも少なかった( サンプル数が10の場合、栽培されたピント豆と野生のピント豆の対立遺伝子数はそれぞれ1.9と3.0であり、親戚10人の場合（5.1）よりも低い値でした。
667個の対立遺伝子バリアントのうち、94個、45個、214個がそれぞれ栽培植物、野生植物、近縁種の植物に固有のものであった。最も多くの対立遺伝子バリアントは栽培豆と野生豆で共有され、最も少ない対立遺伝子バリアントは近縁種グループと野生豆で共有されていた。

遺伝的分化と遺伝的関係の分析

UPGMAによるクラスター分析の結果、栽培種（I）、野生種（II）、近縁種（III）が完全に分離された（図2）。80種の栽培豆は4つのグループに大別され、そのうち、第1グループ（I）の27種の生殖細胞は中国北部に最も多く、81.5％を占め、第2グループ（II）の27種の生殖細胞は中国東北部に最も多く、74.1％を占めた。 クラスターIII(iii)の10個の胚芽のうち8個は安徽省と江蘇省のもので、クラスターIV(iv)の16個の胚芽は、湖北省から5個、北京から3個、吉林省から2個、雲南省から2個、海外から2個、山西省と遼寧省からそれぞれ1個と、幅広い産地のものであることがわかります。栽培されている3種類のイネ科の豆（Vigna umbellata）は第1サブクラスに集まり、野生の小豆に比較的近い。V.hi rt ell a、V.tenuicaulisは第2サブクラスを形成し、V.riukiuensis、V.nakashimae、V.minima、V.trinervia、V.nakashimae、V.minima、V.trinerviaは第3サブクラスであった。 V. trin erviaは3番目のサブクラスでした。 クラスター分析の結果は、主成分分析に基づく2次元の座標プロットと一致した。

ディスカッション

異なる個体群の遺伝的多様性

中国のヒマラヤ山脈周辺の野生キビ集団は、栽培キビよりも遺伝的変異が大きいことが研究で示されている(Zong et al., 2003; Xu et al., 2008)。87個のSSRプライマーペアは、80の栽培キビ集団、22の野生キビ集団、10の近縁種集団において、それぞれ平均4.9、3.7、5.1の対立遺伝子を検出した。 サンプルサイズが小さい場合、検出された対立遺伝子の数はサンプルサイズに比例することが多いので、この結果はサンプルサイズの差が大きいために比較できません(Wang, L. et al., 2004)。 そこで，本研究では，サンプルサイズが遺伝的多様性の評価結果の精度に与える影響を軽減するために，ランダムサンプリング法を用いた。 サンプルサイズが同じ場合，平均対立遺伝子数は，近交系植物＞野生のピントマメ＞栽培のピントマメの順に多くなり，その差は非常に有意であった。 また、多型情報量の平均値も、栽培マメよりも親戚の方が高かった。 このことから、野生マメやその他のマメの親戚は遺伝的バリエーションが高く、栽培マメの遺伝資源を補完するのに有効であることがわかる。

種内・種間の遺伝的背景と遺伝的関係の分析

胚芽資源の遺伝的背景は、しばしばその生息地と関係しており（Wang et al, 2006）、中国におけるキビの生態的ゾーニングのための受け入れられた基準はない（Hu, 1984; Jin, 1995）。 Wangら（2002a）は、RAPDマーカーを用いた中国のキビ生殖資源のクラスタリング分析では、キビグループの分類とその地理的起源との間に有意な関係がないことを示したが、これは使用したRAPDマーカーの数が少なすぎて、明らかになった情報量が限られていたためと考えられる。 これは、その後のAFLP分析により、小豆の生殖質資源の遺伝的背景と地理的起源との間に相関関係があることが明らかになったからである（Wang Shumin and Zhang Chihong, 2002）。 Wang Li-Manら（2009）の分析によると、中国のキビの生殖質資源の遺伝的背景はその地理的起源とより一致しており、中国におけるキビの生態的ゾーニングは北東、北、東、中央、南西の5つのゾーンに分けられることが示唆されている。 今回の調査では、栽培されているレンズ豆を対象としたクラスタリング分析を行い、この見解を概ね支持する結果となりました。 この論文では、中国におけるキビ胚芽の異なる供給源の遺伝的多様性を比較していないが、これは主に中国におけるキビ胚芽資源のサンプリングサイズが小さすぎたためである。 しかし、中国の異なる産地のキビの遺伝的背景を評価し、本研究で蓄積された分子マーカーデータは、新しい遺伝子の再収集・同定・発見や、生殖質の革新のための情報を提供するとともに、異なる地域での適切なキビの育種戦略、特に親の選択とグループ化、子孫の同定のための情報を提供するものである。

しかし、最近の研究では、ブリッジクロップを用いて生殖的隔離を克服し、品種間で抵抗性遺伝子を伝達することが可能であることが示されている（Somta et al. 本研究で分析した材料は、アジアのササゲ亜属の中ではすべてAngularis型であり、クラスタリングの結果、V. trinerviaが他の材料と最も遠い関係にあることがわかり、Angularis型とCeratotropis型の間にあり（Tateishi, 1985）、2つの間の重要な橋渡し親である可能性があるという分類学上の地位がさらに確認された。 このことは、AngularisとCeratotropisの間のタイプとしての分類学上の地位をさらに高め（Tateishi, 1985）、両者の間の重要な橋渡し親としての役割を果たすと考えられる。 また、栽培豆と野生のピントマメの間の遺伝的距離は、他の親戚の間に比べてはるかに小さく、両者の間には生殖的隔離がないため、野生のピントマメの優れた遺伝資源の利用を強化することが重要である。

野生の親戚の育種利用

今回の調査では、栽培されている小豆や野生の小豆には存在しない、小豆の親戚にある214の対立遺伝子が存在した。 ササゲの近縁種には抵抗性に関する優れた遺伝資源が豊富にあることが研究で明らかになっています。例えば、V. naka shima eは茎の腐敗に高い抵抗性を示し(Kaga et al., 2000)、V. trinerviaはマメゾウムシに抵抗性を示します(Credland, 1986)。 私たちのグループが最近行った調査では、中国には小豆や野生の近縁種の野生の供給源が豊富にあることが明らかになりました。 私たちのグループでは、これらの野生資源の評価を強化するために、形態学的観察、染色体核型分析、DNA分子マーカーに基づいて収集した近縁種の分類を開始し、マメ科植物の抵抗性の同定や種間交配に関する研究を行ってきました。

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