大豆の変異原性

概要

人口増加に伴う食糧不安の問題に対処するための技術や進歩を模索することは、常に継続的に行われています。現在の需要に対応した品種や、気候変動に強い品種の生産を増やすことは、時代の要請である。この文献では、大豆の改良における突然変異の応用について紹介しています。変異育種は、新しい遺伝的変異性の創出、作物構造の改善、生化学的体質の強化、成長・発達サイクルの強化において、他の植物育種技術を補完する重要な技術であることが証明されています。突然変異を引き起こす物質は、変異原と呼ばれています。種子や栽培材料に突然変異を誘発するためには、物理的変異原と化学的変異原の両方が使用されます。 変異を誘発した後、様々なフィールドテストで望ましい形質に基づいて変異株が選択され、極端な変異株は破棄されます。最終的には、複数の場所で行われた試験で望ましい変異株のみが新品種として選抜されたり、交配プログラムの親として使用されます。そのため、特に大豆における突然変異の利用や、突然変異を起こすために使用される様々な薬剤については、以下の文献によく記載され、レビューされています。

はじめに

大豆[Glycine max (L.) Merrill]は、高タンパク質、豊富な油糧種子、そして有益な飼料作物という3つの用途を持つことから、奇跡の作物と考えられています。大豆には、アミノ酸を多く含むタンパク質が40％、オメガ6やオメガ3などの多価不飽和脂肪酸を豊富に含む油が20％含まれています。 また、ミネラルも豊富で、総ミネラル量は6～7％、粗繊維は8～10％、炭水化物は17～19％含まれています。これらに加えて、大豆は鉄分、ビタミンB群、イソフラボンなどの微量栄養素を豊富に含んでいます。これらのイソフラボンは、がんの予防、糖尿病の回復、女性の更年期障害など、大豆がもたらす多くの健康効果の主な理由となっています。作物の改良に植物育種が用いられるようになったのは、人類の文明が始まった頃に遡ります。変異育種とは、物理的または化学的な変異原によって生じた遺伝的変異性を利用して新品種を開発することを言います。 変異育種は、古典的な育種技術では既存の生殖細胞の可変性が不十分なために困難な、新しい形質の創出において育種家を大いに助けている。ダイズの突然変異育種は、タンパク質含有量、油分含有量、低フィチン酸含有量などの生化学的形質を強化した品種の開発に役立っています。 また、病害抵抗性、主要な雑草や昆虫など、生物学的および非生物学的な主要なストレスに対する抵抗性も得られます。 以下の総説では、大豆の改良における突然変異誘発の役割について述べています。

変異の種類

突然変異は、すでに定義されているように、生物の特定の形質における突然の遺伝的変化です。これらは、点突然変異として知られる遺伝子の塩基配列の変化によって起こります。突然変異という言葉は、1990年にHugo de Variesによって作られました。 基本的に突然変異は、自然発生的な突然変異と誘発された突然変異の2つのタイプに分類されます。自然発生的な突然変異とは、自然に発生するものであり、その発生頻度は非常に低く、例えば10億分の1である。一方、誘発された突然変異とは、「突然変異誘発剤」として知られる物理的・化学的な物質の助けを借りて人為的に生じたものである。作物の改良のために誘発された突然変異を利用する現象は、突然変異育種として知られています。 自然発生的な突然変異とは異なり、誘発された突然変異は発生頻度が非常に高いため、比較的容易に扱うことができます。

物理的および化学的変異原

変異原を発見し、それを利用して初めてバリエーションを生み出したのは、1928年のHJミュラーです。変異原には、物理的変異原と化学的変異原の 2 種類があります。 物理的変異原には、紫外線、X線、ガンマ線、中性子などの電離放射線があります。 これらのうち、ガンマ線とX線は粒子状でない電離放射線、中性子は粒子状の電離放射線であり、紫外線は非電離放射線です。化学的変異原は4つのカテゴリーに分類されます。すなわち、EMS（エチルメタンスルホン酸）、MMS（メチルメタンスルホン酸）、ニトロソ化合物、ジアゾアルカンなどを含むアルキル化剤。アクリフラビン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイドなどのアクリジン系色素。 塩基類縁体：5-ブロムラシル、5-クロルウラシル、アジ化ナトリウム、ヒドロキシルアミンなど。 図1は、高速中性子で処理された大豆植物で観察された表現型の変化を示しています。(Yung-Tsi Bolon et al.2011) [34]。

大豆における突然変異誘発の応用

形態学的・生化学的形質および細胞遺伝学的変異への影響

Mendhulkarら（2015）[28]が[Glycine max (L.) Merrill]の種子を対象に行った研究では、健康で均一な種子をそれぞれ0.02、0.06、0.1%のEMS（エチルメタンスルホン酸）で4時間と6時間処理した。 その結果、分裂指数の変動、生化学的含有量の変動、染色体異常、および形態学的特性の変動が観察された。すべての処理の中で、0.1%の濃度で6時間処理したものが、最も高いレベルの染色体異常(9.96%)を生じさせ、最も悪影響を及ぼすことがわかった。 有糸分裂指数はコントロールと比較して半分（6.77％）にまで大きく低下した。 生化学的な変化としては、高EMS濃度で長期間処理した場合に高タンパクとなった。 形態学的な変化では、葉縁の変化、早期開花、クロロフィルキメラなどが見られた。 その他の染色体異常としては、染色体の不均等な分布、早熟移動、染色体の遅れなどが挙げられる。 図1,2,3には、本研究で得られた様々な形態学的変異がそれぞれ明確に描かれています。

生理的および定量的特性への影響

変異原ガンマ線の影響は、Adityaら（2017）[2]により、大豆のBSS-2とRKS-18の2品種を対象に、種子の発芽や植物の生存率などの生理的形質について研究された。 両品種で記録された種子の発芽は、チェック品種よりも低いことがわかった。発芽率が低くなった理由は、両品種とも変異原の投与量が多かったためであることがわかった。 しかし、RKS-18と比較してBSS-2では発芽率が高く、RKS-18の苗では生存率が高かったことから、BSS-2では遺伝的損傷が大きいことがわかった。 成熟日数、50％開花までの日数、1株あたりの枝数、1ポッドあたりの種子数、ポッド長、株高（cm）、100種子重（g）、1株あたりのポッド数、1株あたりの収量（g）などの量的形質に対する変異原の影響も記録された。BSS-2とRKS-18の両品種では、一部を除くほとんどの変異原量で、株高、株あたりの枝数、さや長、さやあたりの種子数、株あたりの種子収量などの形質が低下した。この減少の原因は、これらの形質をつかさどる遺伝子がゲノム全体に分布しており、変異原の影響を受けてさまざまな種類の微小変異が生じている可能性があると結論づけられた。

ゲノム編集技術による突然変異誘発

Jianan Hanら（2019）[16]は、北京のダイズを対象とした研究を行い、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、CRISPR/Cas9発現ベクターを栽培品種「Jack」に導入した。これにより、ダイズの開花を司るE1遺伝子の標的変異体を作製した。その結果、E1遺伝子のコーディング領域を11bpと40bp欠失させた変異体と、フレームシフト変異体が得られた。これらの変異体では、翻訳終止コドンが早期に生成され、E1タンパク質が切断されるため、長日条件での開花が早まる。その結果、2つの新規変異体では、E1遺伝子の発現が著しく低下していることから、短縮されたE1タンパク質がGmFT2a/5aを抑制し、GmFT2a/5a遺伝子の発現が拡大することで、明確な早咲きが可能になることがわかった。そこで本研究では、突然変異の概念とアグロバクテリウムを用いた形質転換に加えて、CRISPR/Cas9という最新かつ高度な技術を用いて、大豆品種にCas9発現ベクターを導入し、E1遺伝子をノックアウトして、新規E1変異体の開花への影響を比較した。Chenlong Liらが行った別の研究[24]では、2019年にゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いて、大豆種子タンパク質全体の約70％を構成し、小さな遺伝子ファミリーによってコード化されている2つの主要な貯蔵タンパク質であるコングリシニンとグリシニンの変異対立遺伝子を検出しました。この研究では、9つの貯蔵タンパク質遺伝子を標的としたsgRNAをテストし、そのうち3つの貯蔵タンパク質のDNA変異を大豆の根で検出しました。今回の成果は、このような変異を持つ品種を開発・生産する育種家にとって、新たな有用な資源を生み出す上で大きな役割を果たすと考えられる。

品質向上

大豆油の成分は、パルミチン酸12％、ステアリン酸4％、オレイン酸23％、リノール酸54％、リノレン酸8％である。育種家は、酸化安定性を高め、油の品質を向上させるために、飽和脂肪酸の少ない大豆品種を作ることに常に注力してきた。 これは、リノレン酸を減らし、オレイン酸を増やすことで実現する。Kimら（2015）[20]の研究では、品種PE1690の種子油に含まれる低リノレン酸形質の特徴を明らかにすることを目的とし、この品種はEMSの助けを借りて誘発された突然変異誘発を受けた。 PE1690のDNAを調べたところ、GmFAD3A遺伝子の第2イントロンのスプライス部位に、アデニンの代わりにグアニンを置換する点突然変異が見つかった。 この変異はミスプライシングの原因となり、第2イントロンの334bpがコード配列に取り込まれたことになる。この変異体のアミノ酸鎖を分析したところ、PE1690のトリプトファン（TCG）をコードする128個のアミノ酸の位置が、早発のストップコドンに変化していることが判明しました。したがって、この1点変異により、デサチュラーゼ酵素が機能しなくなってしまったのである。 このPE1690由来のGmFAD3A対立遺伝子とリノレン酸との関係を、Pungsannamul（野生型）×PE1690の交配で生まれた89のF2子孫でテストし、マーカーを用いて解明した。その結果、この変異が種子油中のリノレン酸含量を低下させることが証明された。 Austinら（2017年）[4]が行った別の研究では、使用した変異原は高速中性子でした。変異体集団のスクリーニングでは、野生の表現型と比較して、ショ糖の量が約2倍、油の量が半分以下という異なる表現型が確認されました。しかし、ゲノムハイブリダイゼーション、一括分離分析、戻し交配などの手法を用いて、種子組成の表現型と8番と13番染色体の相互転座との関係を明らかにしました。戻し交配集団における転座は、種子組成表現型と共棲し、非メンデリアン分離パターンを示した。この転座が種子組成の違いの原因ではないかと推測されます。しかし、この変異体は大豆の育種計画において重要な生殖質としての役割を果たすことができるため、この研究は研究の大きな可能性をもたらし、新たな研究の方向性を示している。フィチン酸は、植物組織中に存在する唯一のリンの貯蔵形態である。 Sweta Kumariら（2014）[22]が行った研究では、大豆の17の遺伝子型を化学的変異原であるEMSと物理的変異原であるガンマ線で処理しました。これにより、34の突然変異体集団が発生した。変異体集団M2～M10のスクリーニングは、YMVに対する抵抗性に基づいて行われた。M10では、完全な分析の結果、フィチン酸、タンパク質、ミネラルの含有量が減少した植物があった。 これらの結果から、野生型と比較してフィチン酸の量が少ない5つの変異株、IR-JS-101-4、IR-V-101-3、IR-DS-118-2、IR-DS-119-4、IR-DS-122-2が得られた。

生物学的ストレス耐性

ダイズシスト線虫（SCN）は、ダイズ生産において壊滅的な被害をもたらす病原体と考えられています。この損失に対抗するためには、より多くの抵抗性源を特定し、これらの遺伝子源から新規遺伝子をもたらすことが非常に重要である。この目的でFeng-Yong GEらの研究（2018年）[13]では、ほぼすべてのSCNレースに対して幅広い抵抗性を示すPI 437654の2つのEMS誘導変異体集団（M2）と、宿主抵抗性を示す中国の大豆品種Zhonghuang 13の変異体が作られました。 PI 437654 M2集団の400の変異体をスクリーニングした結果、SCNのレース4に対する抵抗性に変化が見られた13の変異体が同定された。これらの13の変異体について、既知の3つの抵抗性遺伝子のゲノム配列が野生表現型と比較して変化しているかどうかを調べたところ、すべての変異体が大豆の野生表現型とまったく同じようにレース3に対して抵抗性を持つことが明らかになった。したがって、今回の研究では、PI 437654のSCNレース4に対する抵抗性の原因となっている遺伝子に変異があることが明らかになった。 大豆の生産を妨げるもう一つの生物的ストレスは、炭そ病や黄斑モザイク（YMV）などの病気の発生である。 これに関しては、有名な品種JS 93-05の誘導変異体であるAMS-1001がリリースされたことが大きなマイルストーンとなりました。(S.S. Nichal et al. 2020) [29]。この品種は、州のチェックであるMAUS-71と比較して24.17％、国のチェックであるJS-335と比較して20.58％の高い収量を示しました。また、JS-335に比べて油分が23.90%と高い。また、木炭腐朽病やYMVなどの病害に対して高い抵抗性を持ち、生育は定型的で、さやや茎には光沢がなく、花色は紫色です。 この品種はSVRC(State Variety Release Committee)により、マハラシュトラ州ではAMS-1001(PDKV Yellow Gold)という名称で発表され、国名はIC 626343である。

試験管内での応用

突然変異誘発法は、突然変異体を作り出す組織培養技術にも広く応用されている。 Hafezら（2019年）[17]が行ったそのような実験の1つで、大豆品種「Giza 111」の健康なカルリを生産し、2つの化学的変異原（アジ化ナトリウムおよび臭化エチジウム）がその脂肪酸レベルに与える影響を調べた。この培養物をムラシゲ・スクーグ培地で14日間培養したところ、植物体が得られた。 胚軸(H)、胚軸(E)、葉(L)、子葉(C)から誘導したカルスに、異なる濃度の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸とN6-ベンジルアデニンを作用させた。 その結果、HとEのいずれもが、カルスの拡大に最適であることがわかった。HとEのカルスの発生要素を設定した。 カリーの重要な収穫時期は4週目であった。H カリーは成長の早いものであることがわかった。 H カリーには、0.5、1.0、1.5 mM の各変異原濃度で、2 回の浸漬時間（1/2 および 1 時間）で変異原処理を行った。変異原処理1ヶ月後、精製したカルスの脂肪酸プロファイリングを行い、コントロールと比較した。脂肪酸プロファイリングは、ガス流体クロマトグラフィーを用いて行った。 SAsおよびETBrで処理したカルスのFwパターンは，コントロールよりも少ない値を示したが，よく似ていた。しかし，飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の含有量は，濃度と培養時間を拡大することで上昇させることができることがわかった。

大豆の種子保存性に及ぼす変異原の影響

Addai & Safo-Kantanka, (2006) [1]は、60Coガンマ線を0.50,100,150,250,300Gyで照射した3つの大豆品種（Gmx 92-6-10、Gmx 92-5-4E、TGX 87D1303）を対象とした研究を行った。3品種の大量の種子を250Gy（LD50）で処理し、M2世代とM3世代の変種を2つのカテゴリーに分けてスクリーニングした。 第1のカテゴリーは脱穀された種子、第2のカテゴリーは脱穀されていない種子で、温度22-25℃、湿度30-35%の条件下で4ヶ月間実験室で培養した。スクリーニングの結果，80％以上の発芽率を示した種子を選択した。 その結果、M2世代では遺伝子型Gmx 92-6-10から高い貯蔵性を示す変異体が最も多く、M3世代では遺伝子型TGX 87D 1303から最も多くの変異体が記録された。しかし、脱穀した種子のばらつきは、脱穀していない種子よりも大きかったため、脱穀した種子からより多くの選抜が行われた。

将来の展望

地球表面で吸収された太陽光は、長波長の放射線として反射されることはよく知られた事実である。その結果、CO2やオゾン層を破壊するガスが環境中に放出され、そのガスが閉じ込められて熱を増加させるため、世界的な問題となっている地球温暖化が起こります。 しかし、ある研究では、クロロフィルを欠いた突然変異ダイズを畑で栽培すると、吸収ではなく反射される日射量が、市販の品種に比べて多いことがわかっています。 いずれにしても、個々の探索圃場の規模では、収穫サイクルにおける放射抑制への影響は、-4.1±0.6W m-2と非常に大きいことがわかりましたが、現在の品種を全世界でこの遺伝子型に置き換えると、全世界の表面アルベドがわずかに拡大し、4.4GtのCO2eqと比較して、全世界の短波放射量は-0.003W m-2となります。 クロロフィル欠乏突然変異体を媒介とした地表の放射制約を軽減するためには、高収量かつ高アルビノの作物が必要である。

結論と考察

国際原子力機関（IAEA）の突然変異品種データベース（2021年版）によると、ダイズには約182の突然変異品種が記録されています。これらの突然変異は、物理的および化学的変異原の助けを借りて誘発されたものです。表1は、2000年以降に開発された世界の大豆品種のリストです。中国は、大豆の突然変異品種の約43.9％を占めていますが、ドイツ、オーストラリア、ハンガリー、イラク、スロバキア、アルジェリアなどの国は、発表された全品種の約0.54％と最も少ないことがわかりました。 図1は、大豆の突然変異品種の生産における各国の貢献度をグラフ化したものです。 大豆の突然変異誘発について行われた様々な研究は、突然変異育種が作物の改良にとって素晴らしい現象であることを証明していると結論づけています。変異育種は、次世代の育種家が植物育種のマイルストーンを作るのに役立つ新しい生殖質資源を生み出す役割を担っています。変異誘発法は、CRISPR/Cas 9のような最近の進歩した技術や、組織培養のような試験管内での応用にも使用できますが、これは作物改良のためにすべての技術を使った総合的なアプローチを構成していることを示唆しています。変異導入の助けを借りれば、望ましい形質に合わせて作物の遺伝子構成を容易に変更することができ、作物の選択性も高まります。変異育種は、生物学的・非生物学的ストレスによる大豆生産の障壁を取り除き、大豆の品質向上における変異育種の幅広い応用を示す研究もあります。商業作物である大豆は、人間の理想的な食生活の一部であることを証明しています。したがって、大豆がその品質に関して顧客の要求を満たすことは非常に重要であり、突然変異誘発による大豆の品質向上が非常に望ましいのはそのためです。突然変異育種の応用範囲は、大豆だけでなく他の作物にも広く及んでいます。

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