ケモメトリクス手法を用いた小豆栽培品種の栄養成分と生理活性物質の分析 ２

素材と方法

サンプリング

小豆（Vigna angularis）の栽培品種：angularisとniponensisは、生産者から直接入手した。この品種は、ブラジルのパラナ州マリンガ市（23.4000ºS）で栽培されていた。 ブラジル・パラナ州マリンガ市（23.4000º S, 51.9167º W）で栽培されていた。 W）で、2013年9月から10月にかけて栽培された。この地域の平均標高は596m。この地域の平均標高は596mで、9月は春季の始まりです。春の季節です。小豆の収穫を行ったのは 小豆の収穫を行ったのは2013年12月で、降雨量は50～100mmでした。降雨量は50～100mmでした（Instituto Nacional de Meteorologia – inmet, 2012）。) サンプリングは、5kgの小豆を3バッチに分けて行いました。5kg、10日間隔で収穫しました。すべてのサンプルの 小豆をハンマーミルで挽いて粉にしたものを 小豆をハンマーミルで挽いて粉にし，これをふるいにかけて14〜16メッシュの粒度分布にした。14〜16メッシュの粒度分布になるようにふるい分けた。各サンプルの angularisとniponensisの2品種の各サンプルを真空パックして 遮光して真空パックし、分析するまで-18ºCの冷凍庫で保存した。-18℃の冷凍庫で保存した。

近赤外組成と粗エネルギー

水分、灰分、粗タンパク質含有量は Cunniff (1998) に従い、水分、灰分、粗タンパク質含量を、係数 6.25 を用いて窒素の割合を粗タンパク質含量に換算した。蛋白質含量に変換するための係数6.25を用いて測定した（Gohara et al. 総脂質 を抽出し，Bligh and Dyer (1959) に従って抽出・測定した。全炭水化物は以下の方法で算出した。の違いである。
カロリー値は間接法を用いて決定した。間接法（製品の主な栄養素の換算係数の適用に基づいている）を用いて決定した。製品の主な栄養素（炭水化物、粗タンパク質、脂質）の換算係数を (炭水化物、粗タンパク質、脂質）の換算係数を適用する間接法を用いて決定した。Holandsら（1994）による。結果は、食品のcal g-1 の食品に換算し，製品のkJ kg-1に変換した。

脂肪酸組成

脂肪酸組成の測定は 穀物から抽出した脂質画分を用いて行った。これらの脂質は誘導体化され，脂肪酸メチルエステル（FAME）に変換された。メチルエステル（FAME）に変換し、Hartman and Lago (1973). このFAMEは、ガスクロマトグラフ CP-3380 (Varian, USA)に炎イオン化検出器とCP 7420セレクターを取り付けた。炎イオン化検出器とCP 7420-selectameフューズドシリカキャピラリーカラム（100 m x 0.25 カラム（100 m x 0.25 mm x 0.25 μmシアノプロピル）を装着した。
ガス流量は、キャリアガス水素 1.4 mL min-1, ガス流量は、キャリアガス水素1.4 mL min-1、メイクアップガス窒素30 mL min-1、合成空気300 mL min-1、フレームガス水素30 mL min-1であった。サンプルは1：100のスプリット比で注入しました。インジェクターと検出器の温度は 温度は235℃でした。カラムの温度は 165℃で4分間保持した後、4℃/分-1で185℃に昇温し、5分間保持しました。min-1で185℃に昇温して5分間維持した後、185℃から225℃まで10℃min-1で昇温して維持した。から225℃まで10℃/分で昇温し、10分間維持した。このような 同じ条件で他の植物性食品の分析を行った。他の植物性食品の分析にも同じクロマトグラフィー条件を用いている。

その保持時間を、標準的なメチルエステル（Sigma USA）の保持時間と比較しました。脂肪酸を同定するための標準的なメチルエステル（Sigma, USA）と比較した。の同定を行いました。脂肪酸の定量には トリコサン酸メチルエステル（Sigma, USA）を内部標準物質として用いて，脂肪酸の定量を行った。Joseph and Ackman (1992) に従って，内部標準としてトリコサン酸メチルエステル（Sigma, USA）を用いて脂肪酸の定量を行った。ピーク ソフトウェア Star 5.0 (Varian, USA)を用いてピーク面積を決定し 濃度は，全脂質1gあたりのmg FAで表した。濃度は全脂質1gあたりのmg FAで表した。検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は 検出限界(LOD)および定量限界(LOQ)は，希釈したメチル アラキデート標準液（1.0 mg mL-1）を希釈して3回分析することにより，検出限界（LOD）と定量限界（LOQ）を推定した。バックグラウンドシグナルに対するシグナルノイズ率を それぞれ3および10であった（Analytical Methods Committee, 1987). また，いくつかの脂肪酸（FA）クラスの合計も測定した。n-6系およびn-3系の総脂肪酸（それぞれn-6およびn-3と呼ぶ）の合計も測定した。n-6系およびn-3系脂肪酸の合計（それぞれn-6およびn-3と呼ぶ），飽和脂肪酸の合計 (飽和脂肪酸（SFA）、一価不飽和脂肪酸（MUFA）、多価不飽和脂肪酸（PTFE）の 多価不飽和脂肪酸(PUFA)の合計。

脂質の栄養学的品質を示す指標

脂質の栄養学的評価のより良い方法は 脂肪の栄養評価には、脂肪酸組成の機能的効果に基づいたいくつかの指標を利用することです。脂肪酸組成の機能的効果に基づくいくつかの指標を利用することである。指標の算出に必要な脂肪酸は 指標を算出するために要求された脂肪酸は 12:0（ラウリン酸），14:0 (ミリスチン酸）、16:0（パルミチン酸）、18:0（ステアリン酸）。18:1n-9(エライジン酸)、18:2n-6(リノール酸)、20:4n-6 (アラキドン酸）、18:3n-3（α-リノレン酸）、20:5n-3 (エイコサペンタエン酸)、22:5n-3(ドコサペンタエン酸) 22:6n-3（ドコサヘキサエン酸）、およびn-6（オメガ6脂肪酸の合計）の合計は n-6（オメガ-6脂肪酸の合計）、n-3（オメガ-3脂肪酸の合計）、および MUFA（一価不飽和脂肪酸の合計）。指標 本研究で決定した指標は以下の通り。アテローム性の指標 (IA) = [(12:0 + (4 x 14:0) + 16:0)] / (MUFA + n-6 + n-3), 血栓性の指標（IT）＝（14:0＋16:0＋18:0）／（0.5×MUFA＋n-3 / [(0.5 x MUFA) + (0.5 x n-6) + (3 x n-3) + (n-3:n-6)], Ulbricht and Southgate (1991)による。低コレステロール血症患者と高コレステロール血症患者の比率 脂肪酸比率（HH）＝（18:1n-9＋18:2n-6＋20:4n-6＋18:3n-3＋20:4n-6 18:3n-3 + 20:5n-3 + 22:5n-3 + 22:6n-3) / (14:0 + 16:0), Santos-Silva, Bessa and Santos-Silva (2002)による。

トコフェロールの異性体分析

すべてのサンプルをけん化し、ビタミンEの異性体を ビタミンEの異性体をSouzaら（2002）の方法に従って抽出した。Souzaら（2014）に記載された方法に従って抽出した。撹拌下で エタノール50.0mL，アスコルビン酸の水溶液5.0mLを遮光しながら攪拌した。アスコルビン酸10%(w/v)の水溶液10mLと 水酸化カリウム60%(w/v)の水溶液10mLと 水25mLを粉砕試料2.00gに加えた。
不鹸化物の抽出は ヘキサンと水を用いて行いました。トコフェロール画分を含む有機相を回収し，溶媒を を50℃の真空下で蒸発させた。残留物を メタノールに溶解して抽出液を得た。
トコフェロールの異性体（δ-トコフェロール，（β＋γ）-トコフェロール，α-トコフェロール）が得られた。トコフェロール，(β+γ)-トコフェロール，α-トコフェロール）は，高 C18カラム（Microsorb, 250 mm）を用いた高効率液体クロマトグラフィー（Varian社）で測定した。カラム(Microsorb, 250 mm × 4.6 mm, 5 μm粒子) を用いて測定した。移動相は 移動相にはメタノール／ジクロロメタン（85：15）を使用。(v/v)、流速は0.8mL min-1でした（Kornsteiner; Wagner; Elmadfa, 2006）。) トコフェロールの定量は Instituto Adolfo Lutz（1985）に準拠した外部標準法を用いて Adolfo Lutz (1985)に従って外部標準法で定量した。β-トコフェロールとγ-トコフェロールの異性体の合計は γ-トコフェロールの合計を求めた。はこの方法では不可能であるため、β-トコフェロールとγ-トコフェロールの異性体の合計を決定した(Kornsteiner; Wagner; Elmadfa, 2006）。) LODおよびLOQは、以下の方法で推定した。トコフェロールの各異性体の標準検量線を3回分析することにより，LODおよびLOQを推定した。LODおよびLOQは，トコフェロールの各異性体の標準検量線を3回に分けて分析し，バックグラウンド信号に対する信号対雑音比を3および バックグラウンド信号に対する信号対雑音比をそれぞれ3と10とみなして (Analytical Methods Committee, 1987)。

ビタミンE活性

試料中のビタミンEの活性は Kornsteiner, Wagner and Elmadfa (2006) に従いました。(2006)に従って行いました：各異性体で求めた値をミリグラム単位で α-トコフェロール（α-TE）の換算係数を乗じた。(α-TE)を用いた。α-トコフェロールの場合，α-TE＝mg×1.0；（β＋γ）-トコフェロールの場合，α-TE＝mg×1.0。α-トコフェロールはα-TE＝mg×1.0，（β＋γ）-トコフェロールはα-TE＝mg×0.25，δ-トコフェロールはα-TE = mg x 0.01とした。

ミネラルの定量

ミネラル組成分析のために、すべての あずき試料を乾式法で消化した。(Association Of Analytical Chemists-AOAC, 1995)を用いて行った。Ca, Cu, Fe, Mn, Znを原子吸光光度計AA240FSで定量した。Ca, Cu, Fe, Mn, Znは原子吸光光度計AA240FS(Varian, USA)で定量した。を用いて，試料100gあたりの鉱物のmgとして定量した。表1に示したキャリブレーションの技術的パラメータを用いて，試料100gあたりのミネラルのmgとして定量した。LOD およびLOQは，各ミネラルの検量線の標準試料を3回分析することによって推定した。LODおよびLOQは、バックグラウンド信号に対するS/N比を考慮して、各ミネラルの検量線を3回分析して推定した。雑音比をバックグラウンド信号に対する比として、それぞれ3と 10とした（Analytical Methods Committee, 1987）。

食生活基準摂取量の算出

食事摂取基準（DRI）は、1日に必要な栄養素の割合を 食事摂取基準（DRI）とは、米国医学研究所（Institute of Medicine）が定めた、年齢および性別ごとの1日あたりの栄養所要量を 性別ごとの1日あたりの必要栄養素量の割合を示したもので、米国医学研究所（2000 12ヶ月以上の個人を対象にしたものです。ビタミンEのDRIは EのDRIは、小豆100g中の平均量として決定しました。

抽出物の調製と生理活性の評価 特性

小豆の品種からメタノール抽出物を得た。小豆の品種からメタノール抽出物を得た。各サンプル（10g）を メタノール100mL(m/v)を用いて25℃、150rpmで4時間撹拌した後、各試料(10g)を (m/v)を加え，25℃，150rpmで4時間攪拌した後，濾紙（Whatman No. ろ紙（Whatman No.4）でろ過した。各 抽出液を45℃で蒸発させた（ロータリーエバポレーター Büchi R-210, Flawil, Switzerland）でメタノールを除去した。乾燥させた抽出液を 乾燥させた抽出液を、窒素雰囲気（N2）の琥珀色のバイアル瓶に入れた。雰囲気（N2）で保存した。その後、抽出物を再溶解して メタノール溶媒（最終濃度5mgmL-1）に再溶解して 抗酸化作用の評価を行った。最終的に得られたメタノール 最終的に得られたメタノール溶液は、さらに異なる濃度に希釈され 濃度に希釈して，in vitroでの生物活性評価に供した。評価を行った。
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) antioxidant assayの結果は、ICで表されました。(DPPH）抗酸化試験の結果は、IC50値で表されました。(50%の抗酸化活性を示す試料濃度) DPPHラジカル消去活性）で表した。これらのアッセイは ELX800マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA)を用いて評価し、結果をDPPHラジカル消去率として算出した。DPPHの変色の割合として計算した。式を用いて算出した。(ADPPH-AS)/ADPPH] × 100、ここでASは は試料を含む溶液の515 nmにおける吸光度、ADPPHは ここで，ASは試料を含む溶液の515 nmにおける吸光度であり，ADPPHはDPPH溶液の吸光度である。
全フェノール化合物は Shahidi and Naczk (1995)によって提案された方法に従って3連で測定した。and Naczk (1995)によって提案された方法に従って，3連で全フェノール化合物を測定した。抽出液の0.25 mLのアリコート (抽出液（メタノール中2.5 mg mL-1）の0.25 mLを、0.25 mLの 水で1:1に希釈したFolin-Ciocalteu試薬0.25mLと (v/v)、飽和炭酸ナトリウム溶液0.5 mL、および4 mLの水を加えました。反応チューブは3つに分けて、アルミホイルで包み、25℃で保存した。反応チューブをアルミホイルで包み、25℃で25分間、暗所で保存した。
チューブを10分間遠心分離し、上清の吸光度を測定した。上澄み液の吸光度を725nmで測定した。分光光度計(Cary Win UV 50, Varian)を用いて725nmで測定した。胆汁酸 (GA)を標準物質として用い、結果は没食子酸当量(mg) 没食子酸当量（mg GAE 100 g-1 sample）で表した。
フラボノイドの分析は、Buriol et al. Buriolら(2009)が提案した方法に従った。全フェノール測定に使用したのと同じ 全フェノール分析に使用した溶液を全フラボノイド分析に使用した。フラボノイド分析には，総フェノール分析に用いたのと同じ溶液に，5%(m/v)の塩素酸アルミニウム溶液を加えた。溶液を5%(m/v)添加した。形成された黄色の複合体を425nmで測定した。425nmで測定した。結果は以下の単位で表された。ケルセチン当量（mg QE 100 g-1 sample）で表した。

統計・多変量解析

近赤外組成、粗エネルギー、脂肪酸 組成、脂質の栄養学的品質の指標、トコフェロール 脂質の栄養学的品質の指標、トコフェロールの異性体、ビタミンEの活性、ミネラルの定量、抗酸化の特性 定量化および抗酸化物質の特性については 3つの異なるバッチについて3重に実施した。結果は 結果は、スチューデントのt検定を用いて、5％（p<0.05）の有意水準で比較した。有意水準5%(p<0.05)で帰無仮説を棄却して比較した。
多変量解析では，3つのバッチの各レプリケートの個々の値を 多変量解析では，分析した3つのバッチの各レプリケート（n＝9）の個々の値を データの配列に分割した。サンプルの配列は 列（n = 18）に配置し，分析結果を主成分分析（PCA）に用いた。主成分分析（PCA; n = 19）のために選択された を列に配置しました。PCAに用いたこれらのデータは PUFA：SFA (多価不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸の比率）、n-6：SFA PUFA：SFA（多価不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸の比率），n-6：n-3（総オメガ6脂肪酸とオメガ3脂肪酸の比率 n-6:n-3（オメガ6系脂肪酸とオメガ3系脂肪酸の比率）、HH（低コレステロール血症と高コレステロール血症の比率）。低コレステロール血症と高コレステロール血症の脂肪酸の比率 比）、脂質の栄養指標（アテローム性および血栓性の指標 脂質の栄養指標（動脈硬化性および血栓形成性の指標-IAおよびIT）。) ミネラル成分（Ca，Cu，Fe，Mn，Zn），トコフェロールの異性体（α トコフェロールの異性体（α-トコフェロール，（β＋γ）-トコフェロール，δ-トコフェロール トコフェロールの異性体（α-トコフェロール，（β＋γ）-トコフェロール，δ-トコフェロール），ビタミンE活性，および酸化防止剤 抗酸化特性（DPPHラジカル消去活性、総フェノールおよび総フラボノイド フェノール化合物とフラボノイド化合物の合計）。) これらのデータは オートスケーリングにより前処理を行った。このプロセスは 続いて，アルゴリズムNIPALSを用いて主成分分析を行った アルゴリズム「NIPALS」を用いて に分解されました。スコア（サンプル）とローディング（変数）の2次元グラフに分解されました。(変数)の2次元グラフに分解しました。統計ソフトウェアStatistica, version 7.0 (Statsoft, 2007)を使用し，5%(p<0.05)の有意差で評価した。の有意水準で帰無仮説を棄却しました。この同じ 主成分分析の主成分の選択にも同じ有意水準を用いました。主成分分析に使用しました。

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